CUT&RUN技術使用完整的細胞或細胞核來繪制組蛋白翻譯后修飾（PTMs）和染色質相關蛋白（如轉錄因子）的全基因組富集圖譜。在EpiCypher，客戶經(jīng)常會問，“我的細胞樣本適用于CUT&RUN技術嗎? "盡管大家希望所有細胞都可以表現(xiàn)出理想的適用性，但事實并非如此。

在這里，我們將討論EpiCypher在評估CUT&RUN實驗中細胞使用的主要標準。通常情況下，不理想的樣本質量=不理想的CUT&RUN數(shù)據(jù)。

1.細胞數(shù)量

為了獲得可靠精準的實驗數(shù)據(jù)，EpiCypher建議在CUT&RUN實驗中每個反應使用500,000個細胞。在實驗過程中，我們分兩次對細胞進行計數(shù)：第一次是在最初的細胞采集時，第二次是將細胞固定在磁珠上之前。第二次計數(shù)的目的是確保在使用CUT&RUN緩沖液洗滌過程中沒有大量細胞樣本的丟失或細胞裂解的發(fā)生。有關具體指導信息，請點擊技術支持中心了解詳情。

CUTANA™ CUT&RUN成功將選定的目標細胞數(shù)減少到5000個。需要注意的是，使用較低的細胞數(shù)可能會降低CUT&RUN產(chǎn)量，所以需要據(jù)此對文庫制備和測序進行調(diào)整。如果出現(xiàn)這些情況，請點擊CUT&RUN Library Prep Kit手冊以獲得實用建議。

2.細胞活力

EpiCypher在細胞收獲時就會測定細胞活力或“活細胞"的百分比。初始細胞的活力對于CUT&RUN實驗的成功至關重要。低活力可能導致分析背景增加、產(chǎn)量降低以及在實驗過程中細胞/磁珠出現(xiàn)聚集的問題。

值得注意的是，細胞的最佳活力高度依賴于樣本類型。例如，用于CUT&RUN實驗的K562細胞我們要求在培養(yǎng)收獲時有>90%的活力。然而，對于其他某些樣品類型或實驗條件，細胞的最佳活力可能較低。

關于細胞活力和細胞計數(shù)方法的小提示

EpiCypher建議使用簡單的臺盼藍染色方法來計數(shù)細胞并確定初始細胞活力。因為臺盼藍染料對細胞有毒，所以在添加染料后一定要立即計數(shù)。

有些細胞對臺盼藍高度敏感。如果細胞在臺盼藍染色時顯示出較低的活力，但在培養(yǎng)過程中具有預期的形態(tài)、最小的裂解度且能正常生長，那么這些細胞可能適用于CUT&RUN技術。對此，我們建議使用濃度更低的臺盼藍染料或嘗試其他細胞計數(shù)方法（如碘化丙啶）來確認細胞活力。

3.細胞形態(tài)和完整性

CUT&RUN技術需要形態(tài)正常的完整細胞。形態(tài)是指細胞形狀，與組織來源和/或細胞在培養(yǎng)基中的生長方式有關。懸浮細胞，如K562細胞，通常來源于血細胞和/或腫瘤細胞，具有圓形和對稱的形態(tài)。由于貼壁細胞可以來源于上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)元或成纖維細胞組織，因此表現(xiàn)出不同的形態(tài)和擴增特征。例如，上皮細胞往往具有均勻的細胞形狀，可以在細胞培養(yǎng)板上成片生長，而成纖維細胞表現(xiàn)出不對稱、細長的形態(tài)，可用于研究細胞遷移。

使用裂解或質量差的細胞也會導致數(shù)據(jù)質量低。為了確保有效的樣品制備，EpiCypher在初始細胞采集和磁珠結合之前均會檢查細胞形態(tài)和細胞膜的完整性。第二次檢查很重要，因為一些樣品類型（例如FACS分離的細胞或來自組織的細胞）可能對CUT&RUN洗滌緩沖液中的裂解成分更敏感。在這些情況下，我們建議在進行CUT&RUN實驗時分離細胞核（Figure 1）。

Figure 1: Successful isolated K562 cell nuclei. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

4.細胞來源注意事項：細胞系、原代細胞、組織和干細胞

細胞的形態(tài)、活力和數(shù)量會直接受到細胞來源的影響。CUT&RUN實驗使用的細胞可以來自組織、細胞系、培養(yǎng)的原代細胞或通過其他方式純化的細胞（例如FACS）。下面我們將討論這些細胞樣本的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)。

√ 永生化細胞系

示例：HEK293、HeLa、K562、NIH/3T3、MCF-7（Figure 2）、H1299（Figure 3）、A549和THP-1細胞系。

優(yōu)點：一般來說，細胞系是CUT&RUN技術中最容易優(yōu)化的input。細胞系可以提供：

● 大量具有高活力的細胞——CUT&RUN實驗成功的關鍵。

● 精準且可高度重復的CUT&RUN實驗結果——源于細胞系的同質性。

● 用于藥物篩選、基因過表達/抑制等的強大系統(tǒng)——不會破壞樣本質量。

缺點：細胞系的使用有很多注意事項，概述如下。而根據(jù)實驗目的，細胞系可能是最佳的來源選擇。

● 一般來說，細胞系不能代表體內(nèi)條件。它們通常來源于腫瘤細胞或其他病變細胞群，與原代細胞相比，它們的功能可能不同。

● 細胞系容易發(fā)生基因組改變，包括染色體異常、重復和/或遺傳漂移。

● 被其他細胞系污染很常見。錯誤細胞系的鑒定結果可能會妨礙測定的重現(xiàn)性，并導致錯誤的生物學結論。

Figure 2: MCF-7 breast cancer cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 原代細胞

示例：來源于活體組織樣品，固體（如腸、肺、肝、皮膚）或液體（如血液），經(jīng)過或未經(jīng)過細胞培養(yǎng)的均可。

優(yōu)點：原代細胞經(jīng)常用于CUT&RUN，因為研究者使用它們可以：

● 探究在天然異質的細胞環(huán)境中染色質的功能和生物學機制。

● 研究通過FACS或其他技術分離的稀有細胞的功能狀態(tài)。

● 確定細胞對體內(nèi)刺激或藥物治療的反應。

● 表征患者樣本（例如腫瘤VS.健康細胞）。

缺點：原代細胞的缺點取決于研究的組織和細胞類型。在研究原代細胞時，可能面臨的挑戰(zhàn)有：

● 分離足夠數(shù)量的細胞——在分離過程中細胞的敏感性（如FACS）或在組織中的低豐度。

● 獲得具有高活力的細胞——原代細胞通常需要小心處理以防發(fā)生裂解。

● 擴大培養(yǎng)——原代細胞在培養(yǎng)基中的生長能力通常僅限于幾個階段，需要仔細規(guī)劃并優(yōu)化實驗時間表。

● 獲得一致的實驗結果——特別是來源于含有許多不同細胞類型的大塊組織。

Figure 3: H1299 non-small cell lung carcinoma cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 干細胞

示例：誘導多能干細胞（iPSCs）、間充質干細胞和胚胎干細胞。

優(yōu)點：生長和培養(yǎng)多能干細胞群和成體干細胞群的功能使以下研究成為可能：

● 研究細胞發(fā)育、分化和疾病發(fā)展過程中的表觀遺傳學變化。

● 生成用于功能分析和治療開發(fā)的稀有細胞類型。

● 開發(fā)用于個性化醫(yī)療應用的患者特異性細胞群。

● 使用二維細胞和/或類器官培養(yǎng)研究細胞的生長和分化。

缺點：盡管干細胞在細胞和基因治療研究以及發(fā)育生物學方面有前景，但干細胞的研究在許多方面都面臨挑戰(zhàn)：

● 干細胞培養(yǎng)需要豐富的經(jīng)驗，即便如此，擴增某些干細胞群也很困難。

● 培養(yǎng)干細胞需要多種質控措施和精確的監(jiān)測，成本高且耗時。

● 不同研究人員之間的分化方案可能會有所不同，從而引入意想不到的偏差和變化。

EpiCypher的注冊商標和知識產(chǎn)權可見Epicypher品牌。

本文中的所有其他商標和商品均為其各自公司所有。

本文翻譯自Epicypher資料，如與原文有出入的地方，請以英文原文為準。

未經(jīng)EpiCypher公司事先書面同意，本文件不得部分或全部復制。

關于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold™開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領-導者。利用其獨-有技術，不斷增加產(chǎn)品庫中高純度修飾重組核小體（dNucs™）產(chǎn)品。dNuc™多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強大的工具。

EpiCypher還將dNuc™技術廣泛的應用于多種分析測定產(chǎn)品中，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質重塑和抑制劑篩選及開發(fā)），dCyher™測定（用于探究表觀遺傳蛋白質-組蛋白PTM結合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析。

如需了解更多詳細信息或相關產(chǎn)品，請聯(lián)系EpiCypher中國授權代理商-欣博盛生物